綠色無毒安全核酸染料MIDORI Green Xtra用于CRISPR / Cas9實驗

CRIPR / CAS系統已被用作遺傳修飾的工具已有好幾年了。細菌Cas9核酸酶在稱為PAM（proto-spacer adjacent motifs）的DNA中產生雙鏈斷裂，該PAM是基因組中重復的三核苷酸區域。借助合成RNA序列（引導RNA），可以有針對性地修飾DNA中的區域。

雙鏈斷裂通過細胞自身的修復機制修復，例如非同源重組末端連接（NHEJ）和同源直接重組（HDR）。 NHEJ在DNA中產生隨機插入或缺失，從而阻止了正確的蛋白質生產。 HDR在正確的背景下插入DNA序列，從而可以有針對性地修飾蛋白質生產或蛋白質。但是，在這種情況下，通過同源直接修復（HDR）進行修飾的效率明顯低于通過NHEJ意外插入和缺失的情況。可以通過使用兩個sgRNA，在G2 / M中停止細胞周期并添加ssODN（ss寡聚供體）來提高效率，在本文獻中也對所有選項進行了測試。

本文研究了CRIPR / Cas9反應對TNFα的效率。 TNFα調節許多生物過程，可引起類風濕性關節炎等疾病，并且還參與腫瘤的發生和發展。

T7EI核酸酶測定法用于雙鏈斷裂的效率分析。 HDR效率可以通過用SmaI消化來檢查，因為SmaI切割區域已集成到HDR中。

為了進行凝膠分析，瓊脂糖用Midori Green Xtra染色。該染料是一種超靈敏的非致癌性和無毒的核酸染料，非常適合用于藍色或藍色/綠色LED燈的檢測。敏感性和準確度與在致癌性EtBr染色的凝膠中一樣好。

這樣即使在信號較弱的情況下也可以檢測到非常清晰的條帶。通過Midori Green Xtra凝膠染色可以很好地計算HDR效率，因為這種染料非常適合定量。 

原始文獻

Systematic analysis of factors that improve homologous direct repair (HDR) efficiency in CRISPR/Cas9 technique

Paper: PLOS ONE, March 5, 2021, M. Di Stazio et al. (論文鏈接)